靶向沉默Notch1、2和3基因对动脉粥样硬化患者巨噬细胞Notch和核因子-κB信号通路的影响

摘要：目的 探讨靶向沉默Notch 1、2和3基因对动脉粥样硬化患者巨噬细胞内Notch信号通路关键基因Delta-like 4(DLL4)、Jagged 1和核因子-κB (NF-κB)信号通路关键基因IκBα、p52表达的影响,从基因层面研究防治动脉粥样硬化的方法.方法 采集冠状动脉粥样硬化患者静脉血后体外分离单核细胞,并诱导转化为巨噬细胞.将巨噬细胞分为5组:空白对照组(未转染siRNA)、阴性对照组(转染NC-siRNA)、Notch1-siRNA组(转染Notch1-siRNA)、Notch2-siRNA组(转染Notch2-siRNA)和Notch3-siRNA组(转染Notch3-siRNA).分别采用RT-PCR和Western blot法检测各组DLL4、Jagged 1、IκBα和p52的mRNA和蛋白相对表达水平,采用电泳迁移率变动分析(EMSA)检测各组NF-κB活性,采用免疫荧光法检测各组巨噬细胞内p52的分布.结果 (1)RT-PCR和Westernblot检测显示,Notch1-siRNA组、Notch2-siRNA组和Notch3-siRNA组DLL4、Jagged 1和p52的mRNA和蛋白相对表达水平均低于空白对照组和阴性对照组,而IκBα的mRNA和蛋白相对表达水平均高于空白对照组和阴性对照组(P＜0.05或0.01);Notch1-siRNA组DLL4、Jagged 1和p52的mRNA和蛋白相对表达水平均低于Notch2-siRNA组和Notch3-siRNA组,IκBα的mRNA和蛋白相对表达水平均高于Notch2-siRNA组和Notch3-siRNA组(P＜ 0.05或0.01);空白对照组和阴性对照组DLL4、Jagged 1、IκBα和p52的mRNA和蛋白相对表达水平差异均无统计学意义(P均＞0.05).(2)EMSA检测提示,Notch1-siRNA组(613±57)、Notch2-siRNA组(1 169±85)和Notch3-siRNA组(1 454±90)的NF-κB活性均低于空白对照组(2 642±115)和阴性对照组(2 407±100)(P均＜0.01);Notch1-siRNA组的NF-κB活性低于Notch2-siRNA组和Notch3-siRNA组,Notch2-siRNA组的NF-κB活性低于Notch3-siRNA组(P均＜0.01);空白对照组和阴性对照组的NF-κB活性差异无统计学意义(P＞0.05).(3)巨噬细胞核内和胞浆内NF-κB/p52蛋白的总荧光强度Notch1-siRNA组、Notch2-siRNA组和Notch3-siRNA组均低于空白对照组和阴性对照组(P均＜0.01),且Notch1-siRNA组、Notch2-siRNA组和Notch3-siRNA组细胞核内的荧光强度均低于核外(P＜0.01或0.05).空白对照组和阴性对照组细胞核内外的NF-κB/p52蛋白荧光强度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 冠状动脉粥样硬化患者巨噬细胞中Notch信号通路与NF-κB信号通路之间存在正向调节,Notch1基因较Notch2和Notch3基因对NF-κB信号通路的调节作用更显著.