细胞因子-基质金属蛋白酶轴促进小鼠血管内膜增生的机制研究

摘要：目的 观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和血小板源性生长因子(PDGF)在基质金属蛋白酶(MMP)9和(或)MMP2基因敲除小鼠中促进血管内膜增生的情况,并探讨其作用机制.方法 将C57BL/6N小鼠按随机区组法分为对照组、MMP9基因敲除(MMP9-/-)组、MMP2基因敲除(MMP2-/-)组和MMP9/2基因敲除(MMP9/2-/-)组,每组10只小鼠.取对照组小鼠2只,将其股动脉线性损伤,逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TNF-o和PDGF-bb的mRNA表达水平,Western blot法检测MMP9和MMP2的蛋白表达水平,用Odssey图像分析软件测得的蛋白条带灰度值;另取2只对照组小鼠,一只在其血管内膜损伤周围注射外源性TNF-α (5 ng/ml,0.10 ml)、TNF-α(0.05 ml)+ MMP抑制剂SB-3CT (0.50 ng/ml,0.05 ml),另一只注射PDGF-bb(10 ng/ml,0.10 ml)、PDGF-bb(0.05 ml)+ SB-3CT(0.05 ml),观察损伤后2和4周小鼠血管内膜增生情况.MMP9/2-/-组小鼠股动脉内膜线性损伤后2和4周观察其内膜增生情况.MMP2-/-组小鼠股动脉内膜损伤后,在其损伤周围注射TNF-α0.1 ml,MMP9-/-组小鼠损伤血管内膜周围则注射PDGF-bb 0.1 ml,观察各组小鼠血管内膜增生情况.采用Elastica-van Gieson染色法观察小鼠损伤后股动脉内膜增生情况,SigmaPlot测量内膜和中膜面积,并计算其比值.后,取MMP9-/-组和MMP2-/-组小鼠股动脉血管平滑肌细胞(VSMC)培养基,分别给予TNF-α和PDGF-bb干预,进行迁移和增殖实验,测定迁移和增殖细胞数.结果 (1)血管内膜损伤后TNF-α、PDGF、MMP9和MMP2于不同阶段被诱导:对照组小鼠TNF-α、PDGF-bb mRNA表达在血管内膜损伤后1d达高峰,MMP9和MMP2的蛋白表达水平在血管内膜损伤后7和28 d表达水平较高.(2)TNF-α、PDGF-bb分别于血管内膜损伤后不同阶段诱导内膜增生:血管内膜损伤2周时,TNF-α干预较未干预的对照组小鼠血管内膜增生更为明显,内膜比值分别为2.21 ± 0.05和1.55±0.03(P =0.02).血管内膜损伤4周时,PDGF-bb干预较未干预的对照组小鼠血管内膜增生更为明显,内膜比值分别为2.60±0.07和1.89±0.04(P =0.03).(3)血管内膜损伤后不同阶段MMP9和MMP2与血管内膜增生的关系:血管内膜损伤2周时,对照组小鼠血管内膜增生较MMP9/2-/-组明显,内膜比值分别为1.63±0.05和0.46±0.01 (P =0.008).血管内膜损伤4周时,对照组小鼠血管内膜增生较MMP9/2-/-组明显,内膜比值分别为2.24±0.06和0.51±0.01 (P =0.005).(4) TNF-α促进MMP2-/-组小鼠血管内膜增生而PDGF-bb促进MMP9-/-组小鼠血管内膜增生:血管内膜损伤2周时,TNF-α干预与未干预的MMP2-/-组小鼠比较,血管内膜增生较为明显,内膜比值分别为1.73±0.05和1.23±0.03(P =0.02).血管内膜损伤4周时,PDGF-bb干预与未干预的MMP9-/-组小鼠比较,血管内膜增生较为明显,内膜比值分别为2.32±0.06和1.35±0.03(P =0.03).(5) MMP9缺乏抑制TNF-α诱导的VSMC迁移而MMP2缺乏抑制PDGF诱导的VSMC增殖:MMP9-/-组抑制TNF-α诱导的细胞迁移较对照组明显,迁移细胞相对数分别为1.45±0.03和2.16 ±0.04(P =0.03),MMP2-/-组抑制PDGF诱导细胞增殖较对照组明显,增殖细胞相对数分别为1.15 ±0.02和1.82±0.04(P =0.03).结论 血管内膜损伤后的前2周,主要由TNF-α诱导MMP9表达、促进VSMC迁移,而后2周,主要由PDGF诱导MMP2表达、促进VSMC增殖,故TNF-α-MMP9-VSMC迁移轴和PDGF-MMP2-VSMC增殖轴共同组成了内膜的增生机制.